自1986年di一个单抗药物Ortholone OTK3上市，单抗药物经历了鼠源、嵌合、人源化及全人源的发展历程。但自始至终，药物的单克隆性都是作为治疗性单抗的第一要素。

　　生物工艺技术服务作为单抗的生产者，细胞株的单克隆源性就成为了单抗药物研发、生产的重中之重，是产品表达和质量均一性的前提和保证。随着30多年来的单抗药物开发技术及工具的不断发展，各国的FDA对细胞单克隆源性的规则和细节要求在不断提高。

　　1、2011年以前，一般只需要两轮的传统稀释即可。对代替手工分选或铺板的设备，则主要关注这些工具的具体应用流程和如何考察单克隆概率等。

　　2、在2012年，针对有限稀释法，提出需额外提供泊松分布数据来证明所采用的有限稀释法所得到单克隆的细胞株的统计学概率。

　　3、2013年，明确提出必须确认WCB的单克隆源性。

　　4、2014年有FDA官员建议，借助成像方式来证明细胞的单克隆性，可允许一轮的有限稀释。随着单克隆成像仪的不断应用于细胞系开发，FDA的官员也充分认识到该技术的可靠性及严谨性。

　　5、从2016年至今，单克隆成像配合有限稀释法或者高效铺板设备实现细胞株的开发的技术路线已成为全球众多药企的基本工艺方法。

　　为保证细胞株的生物工艺技术服务，一般会采用以下方法：

　　（1）两轮有限稀释。根据泊松分布的原理计算，按照低于0.5 cells/well进行两轮优先稀释，理论单克隆率在95%以上，但是需要注意的是，有限稀释法得到的单克隆是没办法证明为单克隆的，只能推定为单克隆；

　　（2）一轮有限稀释或者单细胞铺板设备搭配单克隆成像设备。不同于概率计算和统计，这个方法可以提供单克隆源性的影像数据，但同时面临一定的挑战。首先，需要考量细胞是否沉底，落孔后细胞的位置等；其次，成像设备的孔位校准、微孔板底聚焦、光源、镜头位移、分辨率等都会影响图像的准确性和有效性。

　　因此，在项目开展前对单细胞铺板以及单克隆成像的整套细胞株构建工艺流程的可靠性进行一定的方法学验证是非常有必要的。

　　从研发的细胞株工艺平台搭建方面，单克隆源性方法学验证后的流程更可控，确立好的SOP更易于执行，极大地降低工艺开发的潜在风险；当项目走到申报阶段，方法学验证后的单克隆成像图片严谨科学，挑战更小，结合细胞库均一性验证的证明，达到双重保险的目的，确保项目申报的细胞株构建环节的内容顺利和快速的通过。

　　如何进行单克隆源性的方法学验证：

　　方法学验证需要基于每个公司的现有工艺平台，如果选择的工艺路线是两轮有限稀释，那么可以根据实际结果结合泊松分布来推算铺板密度的合理性。如果选择一轮有限稀释或者单细胞铺板设备搭配单克隆成像设备，那么就需要考虑铺板后细胞沉底条件、细胞在孔板中位置以及单克隆成像设备对单克隆的识别能力。此外，基于单克隆铺板设备的工艺平台，还需要考量和评估不同项目的交叉污染风险。

　　单克隆验证服务的方法学验证核心步骤：

　　细胞自然沉降工艺验证采用明场成像，考察工艺平台的宿主细胞在平台沉降时间内是否可以沉降，以及不同时间点沉降的效果。

　　离心沉降工艺验证采用明场成像，考察平台宿主细胞在平台离心条件下是否可以沉降，以及离心后不同时间点沉降的效果。

　　细胞识别验证采用明场和荧光场成像，考察成像设备对单克隆的识别情况。

　　单克隆铺板设备项目交叉验证采用明场和荧光场成像，考察不同项目间单克隆铺板设备是否有细胞株交叉现象。

　　关于单克隆方法学验证的实验细节，欢迎1388彩票进行咨询。